CAT#: 15-18620 低温运输，-20℃保存

婴儿利什曼虫探针法荧光定量PCR试剂盒使用手册 V11

产品概述

本试剂盒专为检测婴儿利什曼虫（Leishmania infantum）而设计，该病原体可导致动物源性的内脏利什曼病（黑热病）。研究显示，婴儿利什曼虫感染人类或犬只后可能表现为无症状，然而，这些无症状感染的犬只在疾病的传播中发挥了重要作用。该产品基于探针法的荧光定量PCR技术，具有以下特点：

• 即开即用，用户仅需提供DNA模板。
• 包含阳性对照，有助于识别假阴性样本。
• 反应迅速且灵敏度高。
• 本试剂盒可进行50次20μL体系的探针法荧光定量PCR，仅适用于科研。

规格及成分

本试剂盒包含以下成分：

运输及保存

本试剂盒需低温运输，并在-20℃下保存，保存期限为一年。请注意，阳性对照需单独存放，以避免对其他试剂的污染。用户需自行准备样品DNA和超纯水。

使用方法

一、DNA提取（样本制备区）

使用任意合适方法提取纯化样品DNA，本试剂盒与市场上大多数核酸提取产品兼容。

二、稀释标准曲线样品（样本制备区）

由于阳性对照浓度较高，请在独立区域进行以下稀释操作以防止样品交叉污染：

1. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
2. 在每个管中加入45μL DEPC-H2O。
3. 在7号管中加入5μL 1×10^8拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，获得1×10^7拷贝/μL的标准曲线样品，放在冰上待用。
4. 按相同方式继续稀释，直到获得6个不同稀释度的样品。如果不需要制作标准曲线，则可将阳性对照稀释至1×10^5拷贝/μL。

三、试剂配制（试剂准备区）

假设待测样品数量为N，则准备N+2个qPCR管，并向每个PCR管中加入下列成分：

然后，转移至样本准备区。

四、添加模板（模板添加区）

向qPCR管中分别加入2μL模板，顺序为阴性对照（DEPC-H2O）、待测样品、婴儿利什曼虫qPCR阳性对照，离心30秒并立即进行扩增反应。

五、扩增反应（扩增及产物分析区）

将PCR管放入相应位置的PCR扩增仪器中，进行以下扩增程序：

• 预变性：95℃ 3分钟
• qPCR反应（40个循环）：
• 95℃ 15秒
• 58℃ 20秒
• 72℃ 20秒（采集FAM通道的荧光信号）

探针的荧光基团和猝灭基团分别为：FAM和MGB。

六、结果分析

如果制作标准曲线，则将阳性对照浓度的log值作为横轴，Ct值作为纵轴，绘制标准曲线。随后，根据待测样品的Ct值从标准曲线上推算样品DNA浓度的log值。如果未制作标准曲线，结果判定标准如下：

• 阳性对照：Ct值<30，显示明显的指数增长，呈现典型的S型曲线。
• 阴性对照：Ct值38或无Ct值，无明显指数增长期及平台期。
• 样本检测结果：Ct值<35，表明样品中检测到婴儿利什曼虫，结果为阳性；Ct值38或无Ct值，则结果为阴性；Ct值在35-38范围内需进行复检。

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